世界が新型ウイルス禍の先の見えないトンネルの中、
ミトコンドリア病のこともしっかり見据えたいと思う日々。
田中雅嗣先生から情報をいただきました。
私は、翻訳を読んでもよくわかりません。
でも基本研究の地固めとして何度もかみしめたいと思います。
そして、このように探究を発信してくださる先生に感謝します。
田中雅嗣先生より
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Natureにミトコンドリア病遺伝子治療の新しい方法が報告されました。
部位特異的にCをUに変える酵素DdCBEをミトコンドリアに送り込む。
将来的には、MELASの病因となるm.3243A>G変異を修正できるでしょう。
変異型の塩基配列
5’-GGGCCC-3′
3’-CCCGGG-5’
酵素DdCBEによる塩基変換（C→U）
5’-GGGCCC-3′
3’-CUCGGG-5’
DNA複製でUの反対側にAが取り込まれる
5’-GAGCCC-3′
3’-CUCGGG-5’
DNA複製でAの反対側にTが取り込まれる
5’-GAGCCC-3′
3’-CTCGGG-5’
これは野生型の塩基配列である。
Natureの紹介記事をGoogle翻訳しました。
お送りします。
2020年7月16日号 ┃ NATURE ┃ Nature Research
細菌由来の奇妙な酵素によって、ミトコンドリアDNAの正確な編集が可能に。
科学者がミトコンドリアDNAに対して正確な遺伝子編集を初めて行う
奇妙な酵素は、研究者が致命的な病気を研究し、そして潜在的に治療することを可能にします。
奇妙な細菌酵素により、研究者は人気のあるCRISPR–Cas9ゲノム編集システムでさえ管理できなかった、細胞の重要なエネルギー生成構造であるミトコンドリアのゲノムへのターゲットを絞った変更を達成できました。
ベース編集と呼ばれる遺伝子編集の超精密バージョンに基づいて構築されたこの技術により、研究者はミトコンドリアゲノムの変異によって引き起こされる疾患を研究し、おそらくは治療するための新しい方法を開発することができます。そのような障害は、ほとんどの場合、母親から受け継がれ、細胞のエネルギー生成能力を損ないます。核ゲノムと比較してミトコンドリアゲノムには少数の遺伝子しかありませんが、これらの変異は心臓を含む神経系や筋肉に特に害を及ぼす可能性があり、それらを継承する人々にとって致命的となる可能性があります。
しかし、科学者たちはミトコンドリアゲノムに同じ変更を加えた動物モデルを作成する方法がなかったため、そのような障害を研究することは困難でした。最新の手法は、研究者がそのような対象を絞った変更を行ったのは初めてであり、研究者がこれを行うことを可能にする可能性があります。 「これは非常にエキサイティングな進展です」とフロリダのマイアミ大学のミトコンドリア遺伝学者、カルロスモラエスは言います。 「ミトコンドリアDNAを改変する能力があれば、以前はできなかった質問をすることができます。」この作品は、7月8日にNature1に掲載されました。
病気を探る
この作業はクリニックで使用されるまでにはかなりの時間がかかると、Liu氏は警告しています。彼のチームの初期の研究では、オフターゲットDNAの変化（CRISPR–Cas9遺伝子編集における一般的な問題）はほとんど見つかりませんでしたが、異なる細胞タイプでのさらなる研究が必要であると彼は言います。
この手法は、最終的にミトコンドリア障害の予防または治療に使用される既存の方法を補完することができます。一部の国では、ミトコンドリア置換と呼ばれる手順がすでに許可されています。この手順では、卵または胚の核が、健康なミトコンドリアを含むドナーの卵または胚に移植されます。
研究者はまた、細胞がミトコンドリアゲノムの何千ものコピーを含む可能性があるという事実を利用して、ミトコンドリアの変異を修正する技術を開発しており、多くの場合、これらの一部には疾患に関連する変異が含まれていません。モラエスと他の人々は、ミトコンドリアに入り、有害な突然変異の部位でDNAを切断する酵素を開発してきました。多くの場合、ミトコンドリアは切り傷を修復するのではなく、損傷したDNAを単に分解するだけです。その結果、変異したゲノムのコピーが枯渇したミトコンドリアとなり、最終的には正常なコピーが構造を再形成することが可能になります。
英国ケンブリッジ大学のミトコンドリア遺伝学者であるミハル・ミンチュク氏は、最新の編集アプローチにより、ミトコンドリアに遺伝子の正常なコピーが十分にない場合でも、このような変異を修正できると語った。医学的応用はまだ遠いですが、研究者はミトコンドリアの変異の影響を研究できる動物モデルを生成する技術を使用することにより、短期間で利益を得ると彼は言います。 「これは途方もなく促進することができました」と彼は言います。 「これは驚くべき前進です。」
ミトコンドリアのゲノム編集が正確に
ミトコンドリアと呼ばれる細胞小器官のDNAを正確に変化させることができる細菌毒素が発見されました。この開発は、ミトコンドリアDNAの突然変異によって引き起こされる病気と戦うのに役立ちます。
ミトコンドリアと呼ばれる細胞小器官内のDNAは、わずか13のタンパク質をエンコードし、それらすべてが細胞のエネルギー供給の生成に関与しています。ミトコンドリアDNA（mtDNA）の変異は、人間にさまざまな不治の生命を制限する代謝性疾患を引き起こす可能性があります1。したがって、mtDNAを編集するためのツールの開発は、ミトコンドリア遺伝学で長い間求められてきた目標です。自然を書いて、Mokら2は、初めてmtDNAの正確な編集を可能にする分子ツールを報告します。この成果の鍵は、近隣の細菌を殺すために細菌によって分泌される毒素の発見でした。
Mokらによって発見された細菌毒素。ヌクレオチド塩基シトシン（C）から別の塩基であるウラシル（U）への変換を触媒するDddAと呼ばれるシチジンデアミナーゼ酵素です。 DddAの注目すべき特徴は、それが二本鎖DNAを標的とすることですが、以前に識別されたすべての3シチジンデアミナーゼは一本鎖DNAを標的とします。重要なことに、従来のゲノム編集アプローチには、分子はさみとして両方の鎖のDNAを切断するヌクレアーゼ酵素が含まれますが、DddAは、二本鎖DNAの切断を引き起こすことなくCをUに変換します。これにより、二本鎖DNA切断を修復するための効率的なメカニズムを欠くミトコンドリアゲノムの編集に特に適しています。
研究者たちはミトコンドリアのゲノム編集のためにDddAを再利用するためにいくつかの課題を克服しなければなりませんでした。これらの中で最も重要なのは、シチジンデアミナーゼが哺乳動物細胞に対して毒性であるという事実です。モック等は、 DddAの毒素ドメインを、split-DddAtox半分と呼ばれる2つの非アクティブな部分に分割します。彼らはこれらの半分をTALEタンパク質に融合し、特定のDNA配列に結合するように操作することができます。 2つのTALEをmtDNAにバインドすると、split-DddAtoxの半分が結合され、アクティブになります。
ミトコンドリアマトリックス内のmtDNAに到達するには、TALE–split-DddAtoxが2つのミトコンドリア膜を通過する必要があります。したがって、Mokと同僚は、ミトコンドリアを標的とする信号として機能するアミノ酸配列で構成体にタグを付けました。既存のタンパク質インポート機構5を活用する機能は、このアプローチにCRISPR–Cas9などのゲノム編集のためのRNAガイドシステムよりも大きな利点をもたらします。 CRISPRメソッドはmtDNAでは効率的に機能しません。これは、おそらく細胞がミトコンドリアにRNAをインポートするメカニズムがないためと考えられます6。
別の課題は、シチジンデアミナーゼがCをDNA特異的塩基チミン（T）ではなくUに変換するという事実から生じます。 UはTと同じ塩基対特性を持っていますが、RNAに属しています。塩基は通常、ウラシルDNAグリコシラーゼと呼ばれる酵素の助けを借りてDNAから切り出され、Cで置換されます（参考文献7）7。
モック等は、したがって、TALE–split-DddAtoxの半分をウラシルグリコシラーゼ阻害剤（UGI）と融合しました。これにより、次のラウンドのDNA複製または修復が行われるまでUがグリコシラーゼから保護されます。その時点で、編集前にCとペアになっていた相補鎖のグアニン（G）塩基が、Tと対合するアデニン（A）に置き換えられます。 UGIの組み込みにより、シトシン塩基の編集効率が約8倍に増加しました。
したがって、DddA由来のシトシンベースエディター（DdCBE）と呼ばれる最終的なコンストラクトは、ミトコンドリアターゲティングシグナル、TALEタンパク質、split-DddAtoxハーフ、UGIで構成されます（図1）。モック等は、構築物がヒト細胞のミトコンドリアに効率的にインポートされ、ミトコンドリア遺伝子の選択を変更できることを示しました。 C–GベースペアからT–Aへの編集は、時間の約5〜50％で発生しました。編集の効率はさまざまな要因の影響を受けました。2つのDdCBEサブユニット間の間隔。 TALEデザイン。 split-DddAtoxの半分の向き。そして、TALE結合部位に対する標的シトシンの位置。
すべてのゲノム編集ツールの主な考慮事項は、意図しないサイトのDNAを変更するかどうかです。 Mokと同僚は、処理された細胞と処理されていない細胞を比較し、核ゲノムにオフターゲット効果がないことを発見しました。 mtDNAのオフターゲットアクティビティは、オフターゲット編集がTALE設計にリンクされた1つの遺伝子の場合を除いて、低かった。
次に、モック等は DdCBEの治療の可能性を調べました。著者らは、シトシン塩基の編集には既知の有害なmtDNA変異の49％を修正する可能性があると報告しました。ただし、現在の形式では、DdCBEはゲノム内でTが先行するC塩基のみを効率的に編集して、範囲を狭めることができます。
C–GからT–Aへの変換を実装するためのDdCBEのDNA複製への依存は、理論上の最大編集効率が50％であることを意味します。説明すると、2つの新しく複製されたmtDNAはそれぞれ親のDNAストランドを受け取り、そのうちの1つは編集されず、Gを含み、Cとペアになります。ただし、Mokら。 DdCBEのアクティビティが数日間持続し、その後のレプリケーションイベント中にさらに編集する機会を提供する可能性があることを確認します。 DdCBEへの長期曝露中にオフターゲット効果が増加するかどうかは、将来の主要な考慮事項になります。
これらの警告は、DdCBEがmtDNA変異の完全な除去ではなく、減少を引き起こす可能性があることを意味します。しかし、mtDNA疾患の症状の重症度が変異負荷とともに増加することを考えると8、変異レベル自体を低下させる能力は、治療上の約束を保持します。
ミトコンドリアを標的とするヌクレアーゼは以前、マウスの特定のmtDNA変異を排除するために使用されていました9,10。これが可能なのは、二本鎖切断によってmtDNAが分解されるためです。細胞にはmtDNAの多くのコピーが含まれており、有害な変異を含むコピーのみが分解されます。しかし、突然変異の負荷が高い場合、突然変異したmtDNAを除去すると、mtDNAのコピー数が有害な低レベルに減少する可能性があるというリスクがあります。また、mtDNAのすべてのコピーが同じ変異を持っている場合、ヌクレアーゼアプローチは使用できません。対照的に、ベース編集では、コピー数を減らすことなく、変異を含むmtDNAの割合を減らすことができます。したがって、突然変異の負荷が高い場合は、これが推奨される（または唯一の）オプションである可能性があります。
DdCBEはmtDNA病の伝染を防ぐ可能性がありますか？ MtDNAは通常母親からのみ受け継がれ、現在のミトコンドリア置換手順は、変異したmtDNAを罹患していないドナーの卵に運ぶ女性の卵から核ゲノムを移植することにより、mtDNA変異の伝播を減らします11。卵または初期胚の変異負荷を減らすためのベース編集は、理論的には代替アプローチとなる可能性があります。ただし、mtDNAの複製は人間の発育の最初の5〜6日間は発生しないと考えられているため、成功はUの長期的な保護にかかっている可能性があります。
Mokと同僚の研究は、mtDNA疾患の遺伝子治療の開発に向けた重要な進歩です。さらに、ミトコンドリアゲノムを実験的に変更するツールを使用することにより、複雑な疾患、癌、加齢に伴う細胞機能障害におけるmtDNA変異の関連性をよりよく理解できます。この研究はまた、DdCBEの範囲と効率を向上させるタンパク質工学と進化のさらなる発展を刺激し、他の有望な候補ベースエディターの検索を強化する可能性があります。
（Natureの紹介記事は英字については著作権あり、Google翻訳のみ記載）
田中雅嗣先生の見解
現在の形のDdCBEはゲノム内でTが先行するC塩基のみを効率的に編集するので、適応範囲が限定される。
すなわち
5’-GGGCCC-3′
3’-CCCGGG-5’
を攻撃できない。
まだ改良が必要です。
MELAS m.3243A>G変異を除去できる改良型酵素を創っていると期待！
